層析實驗冷柜廠家淺談層析的四種方法

一、凝膠過濾層析

    凝膠過濾分子篩層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組分按分子大小進行分離的層析技術。具有分子篩作用的物質很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。

    凝膠過濾層析的應用

1、可分離相對分子量從幾百到幾十萬的物質具有3000個理論塔板的凝膠過濾可將分子量相差2倍的蛋白質*分開,6000個理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質*分開;建議柱高在80-120cm,直徑=H/30

2.脫鹽

   凝膠過濾層析的特點：

1、層析柱規模很大，實驗室1.0-2.5×30-100cm，工藝10－20×200cm，從而設備成本很高；

2、上樣體積少，必須少于柱床體積的3％才能達到較好的分離效果，如果大體積樣品必須濃縮，從而造成樣品的損失和增大工藝的復雜性；

3、工藝時間（生產周期）長，甚至24小時或以上；

4、分辨率低；

5、不需摸索純化條件，按照分子量區帶分離。因此，往往用分子篩分離時只適用于純化的后一步，或離子交換上樣前的脫鹽。

二、離子交換層析

    離子交換層析法是以具有離子交換性能的物質作固定相，利用它與流動相中的離子能進行可逆的交換性質來分離離子型化合物的一種方法。

1、緩沖液與pH：選擇適當的緩沖體系，起始濃度要盡可能低些(0.01-0.05M)緩沖液PH值：陽離子低于pI一個pH單位以上陰離子通常高于pI一個pH單位以上。蛋白質在不同pH下保留行為差別較大，所以許對緩沖體系和操作pH進行摸索，以得到佳層析條件。

2、離子強度;洗脫時多采用離子濃度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同鹽濃度（離子強度）及其不同變化率（梯度）條件下保留行為不同，需對該條件進行摸索。一般的，隨離子強度增加，蛋白質保留值減小。

三、疏水層析

原理：基于生物分子表面疏水性不同而達到分離的技術。疏水作用來自于分子的水化結構，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結構，使蛋白質內部的疏水基團暴露于分子外表面，從而可與疏水介質結合。不同離子的疏水性–Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN–Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+。

    蛋白質以高濃度鹽溶液結合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫。生物分子表面大都有或強或弱的疏水區域，在不同環境下，與各種疏水介質產生不同強弱的結合。高離子強度可加強疏水性。跟離子交換相反，高鹽吸附，低鹽洗脫；洗脫樣品又可直接或稍加稀釋后加上其他層析柱，作為連接層析步驟的橋梁，取代鹽析沉淀技術。配體種類繁多，很難預測哪一種、哪一個條件適合，可用疏水層析試盒選擇介質

四、親和層析

    親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的的一類特殊層析技術。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。

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